Autoři: Jakub Gregor 1,2), Blahoslav Maršálek 1,2) Formátování textu a prolinky doplnila Ekotechnika.

  1. Botanický ústav AV ČR, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Květná 8, 603 65 Brno, tel/fax: 543 241 911, e-mail: jgregor@centrum.cz
  2. RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii, Masarykova univerzita, Kamenice 3, 625 00 Brno

Testy toxicity mají v ekotoxikologii dlouhou tradici a jsou hojně používány již desítky let. Využívají desítky různých organismů všech trofických úrovní, mnohé jsou součástí národních i mezinárodních norem a většinou poskytují jasné a poměrně snadno interpretovatelné výsledky. Přestože jsou však jejich krátkodobé varianty označovány jako "akutní testy toxicity", ve většině případů je expoziční doba několik desítek hodin (výjimkou je např. známý Microtox, který trvá 10-20 minut). Tyto systémy proto nejsou schopny okamžitě postihnout krátkodobě zvýšené koncentrace toxických látek ve vodě způsobené např. jejich únikem či úmyslnou aplikací. Proto jsou pro kontinuální monitoring kvality vody vyvíjeny tzv. „biological early-warning systems“, kterýžto termín lze do češtiny přeložit poněkud kostrbatě jako „biologické systémy včasného varování“ a dále v textu jsou pro zjednodušení zmiňovány jako „biomonitorovací systémy“. Jedná se o systémy, v nichž jsou testovací organismy vystaveny kontinuálnímu průtoku analyzované vody a její případné účinky na tyto organismy jsou neustále sledovány a vyhodnocovány pomocí senzorů, CCD kamer apod. Naměřená data jsou okamžitě zpracována v PC a při významných změnách sledovaných parametrů je automaticky vyhlášen alarm.

Význam monitoringu kvality vody a ochrany zdrojů pitné vody za posledních cca 20 let významně stoupl, a to nejen v souvislosti s ojedinělými haváriemi, díky nimž může dojít k významným ekologickým škodám v celém povodí. Vzhledem k mezinárodním událostem posledních let existují reálné obavy z možnosti úmyslné aplikace toxických látek do pitné vody. Proto je biomonitorovacím systémům věnována stále větší pozornost a na jejich vývoji a testování se často podílejí i vládní a armádní organizace. Poněkud překvapivě lze konstatovat, že ve vývoji a validaci těchto přístrojů má Evropa značný náskok před zbytkem světa včetně USA. Především německé a holandské firmy se výrazně chopily příležitosti, a tak třeba v povodí Rýna či Labe najdeme celou řadu biomonitorovacích systémů v běžném provozu. Konkrétně na řece Rýn je nyní 13 lokalit, na nichž najdeme celkem 25 přístrojů využívajících luminiscenční bakterie, řasy, mlže a ryby (podrobný popis viz dále v tomto příspěvku) v různých kombinacích. Pro zajímavost lze také uvést, že v době konání OH 2002 v Salt Lake City byly zdroje pitné vody pro celou oblast monitorovány šesti bbe Daphnia Toximetry od německé firmy bbe-Moldaenke.

Při pohledu do historie zjistíme, že prvním jednoduchým biomonitorovacím systémem (i když nikoliv akvatickým) byl nejspíš onen pověstný kanárek spouštěný v klícce do šachty 1. Jeho případná smrt indikovala přítomnost toxických látek v dole, a tak chudák kanárek svým skonem alespoň dočasně ochránil životy horníků. Mortalita je častým end-pointem i v dnešní ekotoxikologii, nicméně pro biomonitorovací systémy není příliš vhodná. V první řadě jde o otázku citlivosti, protože koncentrace toxikantu musí být samozřejmě dostatečně vysoká, aby způsobila smrt testovacího organismu. Druhým problémem je doba odpovědi, která může trvat i několik desítek hodin, tak jako v klasických biotestech. Moderní biomonitorovací systémy proto sledují nikoliv mortalitu, ale fyziologické a behaviorální parametry. Díky tomu lze detekovat mnohem nižší koncentrace toxických látek, a to prakticky okamžitě.

Tento příspěvek by měl prezentovat základní typy moderních biomonitorovacích systémů s tím, že podrobné informace lze snadno dohledat na internetu či v odborné literatuře. Většina přístrojů je běžně dostupná na komerční bázi, nicméně zmíněny jsou i některé zajímavé předběžné studie z odborných časopisů, které ukazují, jakým směrem se tato problematika může v budoucnosti ubírat.

Obr. 1. Ukázka softwarového výstupu z biomonitorovacího systému. Znázorněn je průběh sledovaných parametrů (v tomto případě pohyb a dýchání ryb) v čase. Zdroj: www.limco-int.com.

Biomonitorovací systémy – rozdělení podle použitých testovacích organismů

Stejně jako v ekotoxikologických biotestech jsou i v biomonitorovacích systémech používány organismy z různých trofických a taxonomických skupin. V komerčně dostupných přístrojích jsou v současné době jsou používány následující typy organismů:

  • bakterie
  • řasy
  • mlži
  • korýši
  • ryby

Bakterie

Na úplný úvod lze uvést přístroj nizozemské společnosti MicroLAN nazvaný TOXcontrol. Má totiž velice blízko k běžně používanému biotestu Microtox. V podstatě se jedná o on-line verzi tohoto systému využívajícího mořskou luminiscenční bakterii Vibrio fischeri. Luminiscence bakteriální kultury je měřena před a po přidání testovaného vzorku a z poměru těchto dvou hodnot luminiscence je počítána inhibice. Další informace lze nalézt na stránkách výrobce www.microlan.nl.

Výrobek NitritotoxMonitor německé firmy LAR (www.lar.de) obsahuje nitrifikační bakterie, u nichž je sledována inhibice respirace toxickými látkami. Sledovaným parametrem je tedy produkce kyslíku před a po přidání vzorku.

V případě bakteriálních biomonitorovacích systémů se tedy nacházíme poměrně blízko klasickým biotestům. Otázkou zůstává např. ekologická relevance použití mořské luminiscenční bakterie pro monitoring sladkých vod.

Řasy

V řasových testech toxicity se nejčastěji vyhodnocuje inhibice růstu po 72 nebo 96 hodinách expozice. Tento parametr je samozřejmě pro on-line detekci toxicity nepoužitelný. V 90. letech zaznamenaly velký rozvoj fluorometry měřící fluorescenční parametry fotosyntézy. Pomocí těchto parametrů lze hodnotit i vliv toxických látek na fotosyntézu. Tento způsob hodnocení používá i bbe Algae Toximeter (bbe Moldaenke). U testovacích organismů (tedy zelených řas) je měřena základní (F0) a maximální (Fm) fluorescence chlorofylu a 2 před a po přidání analyzovaného vzorku. Změny těchto fluorescenčních hodnot indikují možný vliv toxických látek. Přístroj lze zároveň použít pro kvantifikaci řas přirozeně vyskytujících se ve vzorku s rozlišením na jednotlivé skupiny (sinice, zelené řasy, „hnědé“ řasy a skrytěnky). Do určité míry je možná i korekce na zákal vzorku.

Autorská dvojice H. Tahedl a D.-P. Häder z univerzity v Erlangenu (Německo) publikovali v letech 1999 a 2001 výsledky studií, v nichž bylo pro on-line detekci toxicity použito krásnoočko štíhlé (Euglena gracilis) [^3,4]. Pohyb tohoto zeleného bičíkovce byl sledován CCD kamerou a hodnocen softwarově pomocí analýzy obrazu. Mezi sledovanými parametry byly např. procento pohybujících se organismů, rychlost a směr jejich pohybu, gravitaktická orientace, a také změny tvaru buňky, protože tento organismus při náhlé změně okolních podmínek mění tvar buňky z protáhlého na kulatý. Systém je nyní nabízen pod názvem ECOTOX (www.biologie.uni-erlangen.de/botanik1). Citlivost byla podle autorů ve většině případů srovnatelná s Microtoxem.

Mlži

Z bezobratlých živočichů byl jako velice vhodný organismus pro biomonitorovací systémy shledán mlž slávička mnohotvárná (Dreissena polymorpha). Mlži se přítomnosti toxických látek brání zavíráním svých lastur, což je také klíčový parametr pro hodnocení. Počet organismů v systému se pohybuje od osmi po 84 a sleduje se například procento otevřených lastur, aktivita organismů (otevření / zavření) na jeden organismus za časovou jednotku, úhel, pod nímž je lastura oteřena, doba, po kterou jsou lastury otevřené, a samozřejmě i případná smrt (trvale otevřená lastura). To vše je snímáno pomocí elektromagnetických senzorů připevněných na vrchní nebo na obou částech lastury. Možnost využít mlže v biomonitorovacích systémech byla zkoumána od přelomu 80. a 90. let 3, 4. V roce 1996 byl prezentován Musselmonitor 5, který je v současné době vyráběn firmou Delta Consult z Nizozemí (www.musselmonitor.nl).

Korýši

Korýši rodu Daphnia (hrotnatka) patří v ekotoxikologii mezi nejčastěji používané bezobratlé, především díky své citlivosti. Používají se jak v akutních, tak i chronických testech. Proto jejich využití v biomonitorovacích systémech sahá až do 70. let 20. století 6. Původně byla sledována pouze aktivita pohybu dafnií. Po stranách expoziční komory byly nainstalovány zdroje a detektory infračervených paprsků, přičemž počet jejich přerušení odpovídal pohybové aktivitě organismů. Tento typ přístrojů byl hojně používán i v 90. letech 7.

Modernějším typem je bbe Daphnia Toximeter (bbe Moldaenke). Chování dafnií je nepřetržitě sledováno CCD kamerou a vyhodnocováno v PC pomocí analýzy obrazu 8, 9. Vyhodnocovány jsou následující parametry: počet živých dafnií, rychlost pohybu, index rychlosti pohybu (procento jedinců pohybujících se rychlostí nižší nebo vyšší než určené rozmezí), trajektorie pohybu, v jaké výšce ve vodním sloupci se dafnie pohybují, náhlé „propady“ ve vodním sloupci, „seskupování“ organismů i jejich růst (obr. 2). Každému z těchto parametrů je přidělen určitý počet „bodů toxicity“ podle jejich významnosti. Pokud dojde ke změnám v několika parametrech a součet jejich bodů přesáhne stanovený limit, je automaticky vyhlášen alarm.

Obr. 2. Grafické znázornění parametrů hodnocených u bbe Daphnia Toximetru. Zdroj: www.bbe-moldaenke.de.

Ryby

Ryby jsou v biomonitorovacích systémech nejrozšířenějším organismem, a to již od 70. let, kdy pánové Juhnke and Besch 10 představili v roce 1971 systém používající rybu jelec jesen (Leuciscus idus). Jeho chování bylo sledováno pomocí tlakových senzorů na jedné straně akvária, přičemž vyšší počet kontaktů se senzory znamenal snahu ryb uniknout z dosahu působení toxické látky.

Později bylo chování ryb vyhodnocováno vytvořením slabého elektrického pole v akváriu a sledováním změn v tomto poli (princip tohoto mechanismu je znázorněn na obr. 3). Na tomto principu byl založen např. WRc Mk III Fish Monitor, v němž byl jako testovací organismus použit pstruh duhový (Salmo gairdneri) 11, 12. Stejného způsobu využívá i biomonitorovací systém vyvinutý Centrem pro environmentální a zdravotní výzkum Armády Spojených států (na internetu lze informace nalézt na adrese: usacehr.detrick.army.mil/aeam/Methods/Fish_Bio/default.asp). Zde je jako testovací organismus použita slunečnice Lepomis macrochirus. V prvním případě je monitorován pohyb ryb, ve druhém navíc i dýchání (frekvence, „hloubka“) a další pohyby žaber související s tím, že se ryby snaží zbavit obtížného materiálu („kašlání“) 13, 14.

Některé ryby jsou schopny samy „vyrábět“ elektřinu, jako např. tropický nožovec běločelý (Apteronotus albifrons). Změny v tomto bioelektrickém poli mohou indikovat stres způsobený toxickými látkami. Zajímavé je, že tento parametr je sice ovlivnitelný teplotou (resp. jejími náhlými změnami), nicméně další potenciálně rušící faktory (šťouchání, rychlé změny světelných podmínek, míchání vody v akváriu, krmení…) významný vliv nemají 15. Komerčně je podobný systém s názvem Biosensor nabízený americkou společností Biological Monitoring (www.biomon.com).

Stejně jako u dafnií, i u ryb lze jejich chování pochopitelně sledovat pomocí CCD kamery a následné analýzy obrazu. To je případ bbe Fish Toximetru (www.bbe-moldaenke.de) používající danio pruhované (Danio rerio) zvané též zebřička. I jednotlivé parametry a způsob hodnocení je podobný jako u bbe Daphnia Toximetru.

Obr. 3. Sledování chování testovacích organismů pomocí uměle vytvořeného slabého elektrického pole. Převzato z 16.

Multispecies Freshwater Biomonitor

Jak již název napovídá, jedná se o biomonitorovací systém umožňující použití více druhů organismů (až tři druhy najednou, jedná se samozřejmě vždy o bezobratlé živočichy nebo ryby). Opět využívá slabého elektrického pole a jeho změn (obr. 3) pro jejich sledování chování 16. Komerčně je nabízený německou firmou Limco International. V literatuře lze najít desítky studií popisujících použití MFB s různými typy organismů jako jsou např. blešivec obecný (Gammarus pulex), korýši Daphnia magna, Macrobrachium nipponense či Atyaephyra desmaresti, pakomár (Chironomus sp.), ryby halančík (Oryzias latipes) a živorodka komáří (Gambusia holbrooki) a mnoho dalších. Pro zajímavost lze uvést, že použití tohoto biomonitorovacího systému není omezeno pouze na testování vody, ale i sedimentů. Podrobnosti a dlouhý seznam související literatury lze najít na www stránkách www.limco-int.com.

O biomonitorovacích systémech obecně

Jak je zřejmé z předcházejících řádků, problematika biomonitorovacích systémů není v žádném případě záležitostí posledních několika let. Spíš lze konstatovat, že je jim věnována stále větší pozornost, a to z důvodů zmíněných v úvodu příspěvku. Jelikož se jedná v podstatě o „průtokové“ on-line verze klasických biotestů, platí zde řada stejných problémů a limitací. Různé organismy reagují odlišně na různé typy toxikantů. Proto např. na herbicidy budou mnohem citlivěji reagovat řasy než ryby. Z tohoto důvodu se často setkáme s případy, kdy jsou na jedné lokalitě instalovány dva biomonitorovací systémy. Tento problém je částečně řešen přístupem jak bylo popsáno u Multispecies Freshwater Biomonitoru, nicméně ani tím nenahradíme klasickou baterii biotestů (bakterie, řasa,, vyšší rostlina, bezobratlý živočich, obratlovec). Na druhé straně je ovše dobré podotknout, že nám zde nejde o detailní měření toxicity a křivky dávka – odpověď, ale o prvotní rychlé zachycení přítomnosti kontaminantu v analyzované vodě. Výběr testovacího organismu by měl být také samozřejmě ekologicky relevantní, asi není úplně nejvhodnější dávat třeba pstruha do biomonitorovacího systému na dolním toku řeky, kde jsou zcela jiné teplotní a kyslíkové podmínky než v jeho přirozeném prostředí 14.

Asi nejvíce diskutovaným problémem jsou v současné době falešné alarmy, tedy případy, kdy testovací organismy vykáží náhlé významné změny ve svém chování, aniž by ve vodě byly přítomny toxické látky. Tyto události většinou souvisí se změnou ostatních životních podmínek, např. náhlé změny teploty, zákalu, množství kyslíku apod. Proto je naprosto nezbytné, aby zároveň byly kontinuálně monitorovány ostatní důležité parametry kvality vody. Je ovšem nutné zdůraznit i skutečnost, že změny pH, kyslíku, teploty apod. mohou souviset s úniky toxických látek do vodního prostředí a mohou případně z hlediska biomonitorovacího systému „maskovat“ jejich přítomnost 14. Falešný alarm může být ovšem způsoben např. i chybou nebo nesprávným nastavením softwaru. Proto výrobci většinou umožňují širokou škálu různých nastavení detekčního systému, které lze aplikovat v nejrůznějších podmínkách, na různé kultury a kmeny testovacích organismů („Máme ve Španělsku nějaké nervóznější dafnie“ – I. Hurtado, 2004, workshop v Kielu). U systémů využívajících kamerové sledování může nastat problém s pevnými částicemi, které se přirozeně vyskytují ve vodě. Proto je důležitá i filtrace vody před přívodem do biomonitorovacího systému. Např. u dafniového toximetru se stávalo, že software považoval větší částice za malé dafnie a jejich klesání ke dnu a neochotu se čile pohybovat také náležitě vyhodnotil. Na druhé straně mnoho toxikantů bývá vázáno právě na tyto částice, proto je velmi důležitý i výběr filtru při předúpravě vzorku.

V blízké budoucnosti asi nelze v Česku očekávat masový rozvoj v používání biomonitorovacích systémů; náklady na instalaci většinou překračují hranici 1 mil. Kč. Nicméně určitě je dobré vědět, že zde existuje kontinuální on-line alternativa k standardním ekotoxikologickým biotestům, která má své důležité místo v akvatické ekotoxikologii. Jedná se o automatizované systémy s poměrně malými nároky na obsluhu. Doba odpovědi na přítomnost toxických látek je maximálně několik hodin, což je řádově méně než u standardních biotestů. V řadě případů se však jedná o poměrně nově vyvinuté systémy, proto je nutná jejich další validace v praxi. Další vývoj lze očekávat směrem k miniaturizaci, komplexnějšímu sběru a vyhodnocování dat a redukci pořizovacích a udržovacích nákladů.

Použitá literatura:

  1. Burrell, G.A. (1912): The use of mice and birds for detecting carbon monooxide after mine fires and explosions. Department of the Interior, Bureau of Mines, Washington DC, Technical Paper No. 11. ↩︎

  2. Genty, B., Briantais, J.-M., Baker, N.R. (1989): The relationship between the quantum yield of phytosynthetic transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta 990, 87-92. ↩︎

  3. Kramer, K.J.M., Botterweg, J. (1991): Aquatic biological early warning systems: an overview. In: D.W. Jeffrey and B. Madden (eds): Bioindicators and environmental management, pp. 95-126. London: Academic Press. ↩︎

  4. Borcherding, J. (1992): Another early warning system for the detection of toxic discharges in the aquatic environment based on the valve movements of the freshwater mussel Dreissena polymorpha. In D. Neumann and H.A. Jenner (eds): Limnologie aktuell – Vol. 4 – the zebra mussel Dreissena polymorpha – ecology, biological monitoring and first applications in water quality management, pp. 127-46. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag. ↩︎

  5. Sluyts, H., Van Hoof, F., Cornet, A., Paulussen, J. (1996): A dynamic new alarm system for use in biological early warning systems. Environmental Toxicology and Chemistry 15, 1317-1323. ↩︎

  6. Knie, J. (1978): Der dynamische Daphnientest – ein automatischer Biomonitor zur Überwachung von Gewässern und Abwässern. Wasser Boden 12, 310-312. ↩︎

  7. Hendriks, A.J., Stouten, M.D. (1993): Monitoring the response of microcontaminants by dynamic Daphnia magna and Leuciscus idus assays in the Rhine delta: biological early warning as a useful supplement. Ecotoxicology and Environmental Safety 26, 265-279. ↩︎

  8. Lechelt, M., Blohm, W., Kirschneit, B., Pfeiffer, M., Gresens, E., Liley, J., Holz, R., Lüring, C., Moldaenke, C. (2000): Monitoring of surface water by ultra-sensitive Daphnia-Toximeter. Environmental Toxicology 15, 390-400. ↩︎

  9. Green, U., Kremer, J.H., Zillmer, M., Moldaenke, C. (2003): Detection of chemical threat agents in drinking water by an early warning real-time biomonitor. Environmental Toxicology 18, 368–374. ↩︎

  10. Juhnke, I., Besch, W.K. (1971): Eine neue Testmetode zur Früherkennung akut toxischer Inhaltstoffe im Wasser. Gewasser Abwasser 51/52, 107-114. ↩︎

  11. Evans, G.P, Wallwork, J. F. (1988): The WRc fish monitor and other biomonitoring methods. In: Gruber D. and Diamond J. M. (eds): Automated Biomonitoring, pp. 75-90. Horwood, Chichester. ↩︎

  12. Baldwin, I.G., Harman, M.M.I., Neville, D.A. (1994): Performance characteristics of a fish monitor for detection of toxic substances – I. Laboratory trials. Water Research 28, 2191-2199. ↩︎

  13. Shedd, T.R., van der Schalie, W.H., Widder, M.W., Burton, D.T., Burrows, E.P. (2001): Application of an automated fish biomonitoring system for continuous effluent acute toxicity surveillance. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 66, 392-398. ↩︎

  14. van der Schalie, W.R., Shedd, T.R., Knechtges, P.L., Widder, M.W. (2001): Using higher organisms in biological early warning systems for real-time toxicity detection. Biosensors and Bioelectronics 16, 457-465. ↩︎ ↩︎ ↩︎

  15. Thomas, M., Florion, A., Chrétien, D., Terver, D. (1996): Real-time biomonitoring of water contamination by cyanide based on analysis of the continuous electric signal emitted by a tropical fish: Apteronus albifrons. Water Research 30, 3083-3091. ↩︎

  16. Gerhardt, A., Clostermann, M., Fridlund, B., Svensson, E. (1994): Monitoring of behavioral patterns of aquatic organisms with an impedance conversion technique. Environment International 20, 209-219. ↩︎ ↩︎